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«生命的化学»2001年21卷1期
王志军1 乐国伟1 施用晖1 汪 垣2
(1无锡轻工大学动物科学教研室，无锡214036；2中国科学院上海生物化学研究所，上海 200031)
关键词：外源DNA；代谢；肠胃道；DNA甲基化
中图分类号：Q591.3
外源DNA在动物体内的吸收与降解研究已经受到了关注[1、2]。由于基因治疗与DNA疫苗的飞速发展，经常要通过一定的方式将外源的DNA导入到动物体，然而对于它们的吸收与降解机制到目前为止仍然不是十分清楚。用基因治疗疾病时，须解决外源基因在动物体内的吸收与降解问题，尤其是大量外源DNA质粒在动物与降解研究已成为一个热点，目前主要集中在肠胃道吸收降解和细胞吸收降解两个方面。
1. 外源DNA在肠胃道中的吸收与降解
最有可能让外源DNA进入动物体的就是肠胃道，在每天的进食中，肠胃道会和外源食物DNA接触几个小时。用噬菌体M13 DNA来研究外源DNA在小鼠体内的吸收与降解情况发现，食物中的外源DNA在鼠肠胃道中是不完全降解的[3]。用探针杂交、PCR或FISH技术可以研究外源DNA的踪迹。在84只不同的小鼠中，M13 DNA可在小鼠的小肠、盲肠及粪便中检测到[3、4]；在254只小鼠中，M13 DNA的976个碱基片断可在小鼠进食后的8小时在血液中检测到；然而对照组中却没有发现M13 DNA片断。在小鼠进食后的24小时内通过PCR的方法在血液白细胞的表面，以及用FISH技术在0.4%的肝白细胞中可检测到M13 DNA片断，另外M13 DNA也在脊柱上皮细胞、盲肠端淋巴结的白细胞、B细胞、T细胞和脾中的巨噬细胞中检测到，这些结果说明了外源DNA能通过肠胃道经淋巴结进入白细胞及其它组织。然而在进食时间大于24小时后，M13 DNA就不能用PCR或FISH的方法在以上组织中发现，这表明外源DNA发生了显著的降解。将插有M13 DNA的小鼠脾细胞DNA再次克隆入质粒载体中，通过DNA顺序分析技术发现，这些克隆中之一含有M13 DNA约1300个碱基片段。有70%的M13 DNA片断与小鼠中的IgE受体基因相连[4]。以上说明了肠胃道对于外源DNA的进入不是一个不可穿越的屏障。但是到目前为止，仍然不知道肠胃道吸收外源DNA的程度以及降解程度，吸收外源DNA后会主要作用于那些细胞，这方面需进一步做深入的研究。
2. 外源DNA在细胞中的吸收与降解
外源DNA在动物细胞中的吸收与降解研究在近几年受到了重视[1、2、5]，目前主要集中在以下几个方面：
(1)外源DNA经非序列依赖性DNA结合蛋白内吞入细胞核。正常机体细胞中存在DNA结合蛋白，它主要分布于细胞核内作为转录调控因子。近年来研究发现胞质中也存在一些DNA结合蛋白，Hagstrom纯化出了家兔骨骼肌肌浆网膜上存在的非序列依赖性DNA结合蛋白，分子量分别为95 kD、60 kD、28 kD[6]。
(2)吸收后的外源DNA一部分在核酸酶的作用下发生降解，未发生降解的外源DNA则插入细胞基因组DNA中，并且会多次插入动物细胞基因组中。插入基因组后，防止了外源DNA受核酸酶的降解[1]。在细胞中所发现的外源DNA片段与所吸收的外源DNA片段不会完全一样，主要是由于DNA片段在进入细胞核时发生降解的缘故。外源DNA插入基因组后会影响细胞基因组的碱基序列，在插入位点附近常发生从零到几千个碱基的缺失或突变。通过FISH技术及核酸序列分析技术，发现很多插入位点是随机的，没有选择性。用计算机辅助分析，发现在外源DNA与细胞DNA连接处可形成环状结构[2]。在插入位点附近大约100个碱基范围的核酸序列常发现具有转录活性。
(3)未被降解的外源DNA插入细胞基因组后，将导致不可预见的后果。一旦核酸酶未对外源DNA完全降解，而使外源DNA插入基因组后，细胞会启动将外源DNA甲基化这一最后防卫系统，使外源DNA得到有效控制。实验发现，外源DNA在细胞中的甲基化是一种普遍存在的现象[7]。用Ad12 DNA转化仓鼠细胞后，发现仓鼠基因组及Ad12 DNA的甲基化水平明显提高[8]。当然，这种防卫系统对于转基因生物及人体细胞基因治疗来说是一种障碍，甲基化后使外源基因失去表达活性对于想用实验方法来得到转基因生物及基因治疗是不利的。存在于基因组中的甲基化外源DNA经常是不稳定的，在一定的情况下常发生甲基化的胞嘧啶突变为胸腺嘧啶，这种突变很大程度上与细胞产生癌基因表现型相关[9]。
(4)由于外源DNA的甲基化，而导致了它在分裂过程中不稳定。通常在细胞的最初几次分裂中甲基化的外源DNA片段是比较稳定的，然而经过一定的分裂次数后，外源DNA会通过目前仍不清楚的机制而完全降解，从而从基因组中丢失[1]。
3. 展望
外源DNA的吸收与降解只是在个别动物中做了研究。对基因治疗与DNA免疫用质粒DNA在组织中的吸收与降解研究仍很少。Chun[10]在动物鼻粘膜中供给少量DNA疫苗后，分析DNA疫苗的分布与降解情况，实验发现DNA疫苗可以快速分布于全身，质粒DNA可在血浆、淋巴结、脾、肝、骨髂中检测出，经3个月后，除了注射位点之外，质粒DNA已不能检测出，但质粒所代码的蛋白质可在血浆与组织中检测到。然而很多问题还有待进一步研究，如外源DNA的降解动力学，在肠胃道中的吸收与排出程度，如何有效防止质粒的降解以增强基因治疗与DNA免疫的作用[11]等。
参考文献
[1] Doerfler W et al. Gene,1995,157:241-245
[2] Doerfler W. Biochim Biophys Acta,1996,1288:F79-F99
[3] Schubbert R et al. Mol Gen Genet,1994,242:495-504
[4] Schubbert R et al. Proc Natl Acad Sci USA,1997,94:961-966
[5] Knoblauch M et al. J Virol,1996,70:3788-3796
[6] Hagstrom JE et al. Biochem Mol Med,1996,58:113-121
[7] Doerfler W. Curr Top Microbiol Immunol,1995,197:209-224
[8] Hilde H et al. Proc Natl Acad Sci USA,1995,92:5515-5519
[9] Costello JF et al. Nat Genet,2000,24:132-138
[10] Chun SJ et al. J Immunol,1999,163:2393-2402
[11] Singh M et al. Proc Natl Acad Sci USA,2000,97:811-816 |
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狗仔卡
发表于 2014-10-24 23:36
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发表于 2014-10-27 17:48
